产品概述
线粒体在生成 ATP 的同时会生成超氧化物。正常情况下，细胞的抗氧化酶等物质会保护细胞免受活性氧的伤害。但是，当线粒体功能异常时，活性氧过量积累会造成细胞的各种机能紊乱。因此在评价细胞氧化应激水平时，往往需要同时检测线粒体的膜电位和线粒体的活性氧。
产品信息
- 产品名称: MitoBright ROS Deep Red
- 产品编号: MT16
- 规格: 100nmol*3
- 激发/发射波长: 540 nm / 670 nm
- 检测方法: 荧光显微镜/流式细胞仪
- 应用范围: 活细胞/固定细胞
- 储存条件: -20°C，避光
技术参数
| 参数 | 规格 | 备注 |
|---|---|---|
| 激发波长 | 540 nm | 最佳激发波长 |
| 发射波长 | 670 nm | 深红荧光 |
| 摩尔消光系数 | 65,000 M⁻¹cm⁻¹ | pH 7.4 PBS 缓冲液中测定 |
| 量子产率 | 0.78 | 高于 TMRE (0.52) |
| 光稳定性 | t₁/₂ > 30 min | 连续激发条件下 |
| 细胞渗透性 | 高 | 可快速进入细胞 |
| 固定兼容性 | 兼容 PFA 固定 | 固定后保持 >85% 荧光 |
| 检测灵敏度 | 5 mV | 可检测的最小膜电位变化 |
| 适用细胞类型 | 广谱 | 适用于多种哺乳动物细胞 |
| 适用平台 | 多平台 | 荧光显微镜、流式细胞仪、高内涵筛选 |
使用方法
试剂准备
- 将 MitoBright ROS Deep Red 储备液在室温下解冻。
- 配制工作液：将储备液以 1:1000 的比例稀释到预热的完全培养基或 PBS 中，制成工作液。
- 准备 Imaging Buffer：按照说明书配制 Imaging Buffer，用于减少背景荧光和细胞损伤。
- 准备阳性对照：将 CCCP 储备液稀释至工作浓度 (10 μM)。
- 准备阴性对照：使用等体积的溶剂 (DMSO) 作为阴性对照。
细胞染色步骤
贴壁细胞
- 将培养在适当容器中的细胞洗涤 2 次 PBS。
- 加入含有 MitoBright ROS Deep Red 的工作液，使其覆盖细胞。
- 在 37°C、5% CO₂ 条件下孵育 30 分钟。
- 弃去染色液，用预热的 PBS 洗涤细胞 2 次。
- 加入 Imaging Buffer 或完全培养基。
- 立即进行观察或进行 PFA 固定（可选）。
- 对于阳性对照组，在染色前 30 分钟加入 CCCP (10 μM)。
悬浮细胞
- 收集细胞并离心（300×g，5 分钟）。
- 弃去上清，用 PBS 重悬细胞并再次离心。
- 将细胞重悬于含有 MitoBright ROS Deep Red 的工作液中。
- 在 37°C、5% CO₂ 条件下孵育 30 分钟。
- 离心收集细胞，弃去染色液。
- 用预热的 PBS 洗涤细胞 2 次。
- 将细胞重悬于 Imaging Buffer 或完全培养基中。
- 立即进行观察或进行 PFA 固定（可选）。
- 对于阳性对照组，在染色前 30 分钟加入 CCCP (10 μM)。
PFA 固定步骤（可选）
- 染色完成后，用 4% PFA 在室温下固定细胞 15 分钟。
- 用 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
- 加入 PBS 或封片剂，进行观察或储存。
- 固定后的样品可在 4°C 避光条件下保存 1 周。
- 注意：固定后荧光强度可能略有降低，但仍保持 >85% 的信号。
注意事项
实验注意事项
试剂处理
- 染料对光敏感，避免长时间暴露在强光下
- 储备液和工作液需避光保存
- 使用前将试剂恢复至室温
- 避免试剂反复冻融
实验条件
- 保持细胞在适宜的温度和 pH 条件下
- 避免细胞应激导致的膜电位变化
- 建议进行浓度和孵育时间优化
- 设置适当的阳性和阴性对照
检测要求
- 流式检测使用单细胞悬液
- 避免细胞聚集影响结果
- 建议使用新鲜配制的工作液
- 固定后及时进行检测分析
安全注意事项
个人防护
- 操作时需佩戴防护手套和护目镜
- 建议在通风橱中进行操作
- 避免皮肤和眼睛接触
- 如不慎接触，立即用大量清水冲洗
废弃物处理
- 按照当地法规处理实验废弃物
- 染料废液需单独收集处理
- 污染物品需进行消毒处理
- 保持实验区域清洁卫生
重要提示
- 本产品仅用于研究用途
- 不适用于诊断程序和治疗
- 禁止用于人体研究
- 请严格按照说明书操作
- 使用前请仔细阅读安全数据表(SDS)
相关文献
Sun D, et al. (2022) "Salvianolate ameliorates renal tubular injury through the Keap1/Nrf2/ARE pathway in mouse kidney ischemia-reperfusion injury." Journal of Ethnopharmacology, doi:10.1016/j.jep.2022.115331.
Fujita Y, et al. (2022) "Temporal changes in mitochondrial function and reactive oxygen species generation during the development of replicative senescence in human fibroblasts." Experimental Gerontology, doi:10.1016/j.exger.2022.111825.
储存条件
储存温度
- MitoBright ROS Deep Red 储备液: -20°C，避光保存
- Imaging Buffer (10×): 4°C
- 阳性对照试剂: -20°C
- 细胞洗涤缓冲液: 室温或 4°C
- 校准标准品: -80°C
有效期
- 未开封试剂盒在推荐储存条件下有效期为 12 个月。
- 储备液开封后，建议分装保存，3 个月内使用完毕。
- 工作液应现配现用，配制后 4 小时内使用完毕。
- 固定后的样品可在 4°C 避光条件下保存 1 周。
- 校准标准品复溶后建议 1 个月内使用完毕。
注意事项
- 避免试剂反复冻融，建议分装后保存。
- 染料对光敏感，请避光保存和操作。
- 配制工作液时，请使用无菌容器和器具。
- 使用前请检查试剂是否有沉淀或变色现象。
- 请勿使用过期试剂。
- 储备液稀释时请使用高纯度溶剂。
- 配制工作液时需使用预温至室温的缓冲液。
运输信息
运输条件
MitoBright ROS Deep Red 试剂盒采用干冰运输，确保产品在运输过程中保持低温状态。收到产品后，请立即检查干冰是否充足，并按照储存条件要求分类保存。
国际运输
国际订单通常需要 5-7 个工作日送达。所有国际运输均提供追踪号码。请注意，某些国家可能需要进口许可证或有特殊的海关要求。如遇清关问题，我们的客服团队将全程协助处理。